外出度假时，把实验室里在培养皿中正生长着细菌这件事给忘了。3周后当他回实验室时，发现一个与空气接触过的金黄色葡萄球菌培养皿中长出了一团青绿色霉菌。弗莱明用显微镜观察这个培养皿时发现，霉菌周围的葡萄球菌菌落已被溶解。
这提示霉菌的分泌物能抑制葡萄球菌的生长和繁殖。后来鉴定表明培养皿中的霉菌为青霉菌，1929年弗莱明发表其研究成果并把这种青霉菌分泌的杀菌物质称为青霉素。
后来研究发现，青霉素之所以既能杀死病菌，又不损害人体细胞，原因就在于青霉素所含的青霉烷能使病菌细胞壁的合成发生障碍，导致病菌溶解死亡，而人和动物的细胞没有细胞壁。
但直到1942年开始对青霉素才进行大批量生产，这对于医疗史具有里程碑式的意义。